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温度敏感性材料于细胞疗法与再生医学之应用
生化生医所 赖瑞阳助理教授
李雅婷研 究 生
人体的组织器官易随着年龄增长或疾病感染等因素而受到损害，严重时甚至可能导致生理机能异常。然而体内自我修复的能力极为有限，因此通常只能寻求医疗技术的帮助。组织或器官移植乃临床上普遍用以治疗疾病的方式，但碍于捐赠来源不足及免疫排斥等问题，再生医学 ( regenerative
medicine ) 的兴起，迅速掀起一股热潮，其目的即是希望藉由体外制备与体内移植组织工程产物，使患者之受损组织达到形态、结构与功能上的重建。
再生医学的发展初期，是以细胞注射疗法 ( cell delivery
therapy ) 为研究主轴。学者将各种来源的健康细胞悬浮液注入接受者受损部位，以替代坏死细胞，并发挥正常功能。临床上成功的案例包括：藉由注射从夭折胎儿获得的神经细胞治疗帕金森氏症及亨丁顿舞蹈症等。但是，此方式具有下列缺点：注入的细胞在体内不易控制其大小、形状与分布，且细胞移植物经常呈现个别分散的群落聚集，难以正确贴附于欲修复的组织部位，或无法完全地与宿主组织融合，甚至可能造成其他综合症。
提出组织工程 ( tissue engineering ) 概念，主要是利用生物可降解型材料建构一人工支架，用于体外培养细胞，并辅以讯息因子，制造仿生组织，再植入病患体内进行治疗。此项研究在临床上已有多次成功案例，且至今仍广受学者热烈探讨与研究；然而此法也存在一些问题与限制。在立体结构的支架中，由于质传障碍，营养物与代谢废物均不易进出，因此，内部中心区域的细胞容易坏死，造成以支架所培养的细胞层无法达到天然组织厚度。再者，外来物的植入容易引起体内发炎与免疫反应。而随着人工支架分解，原本受材料占据的空间会被细胞分泌的细胞外基质 ( extracellular
matrix ) 与纤维组织所填补替换。就硬组织 ( 如：骨头 ) 工程而言，此原理确能获致相当好之再生效果，因骨的组成主要为基质与少量细胞。但在细胞含量高的组织类别 ( 如：心或肝 )，支架降解过程往往导致组织纤维化等病理状况生成，反而不利于培养的细胞进行组织再生。故以人工支架所开发的组织工程方法，并不适用于重建细胞密度高的组织部位。
为克服组织工程固有的限制，近几年来，学者已发展一种崭新的模式：细胞层片组织工程(cell sheet
engineering)，主要针对细胞密度高的组织进行再生医学应用。该技术乃采用温度敏感型高分子材料作为细胞培养基质，藉由材料具有随环境温度变化而生成相转变的特性，使细胞自发地脱离培养基质，而获得一完整结构的生医工程细胞层片。
一般而言，细胞于体外培养过程会分泌细胞外基质，这些成分中含有大量的贴附蛋白，有助于细胞附着在培养基材表面。因此，当细胞扩增后，经由蛋白分解酵素的处理，可使细胞脱离培养界面。但此法不仅能裂解细胞外基质，同时也会破坏细胞膜的离子通道、生长因子受体及细胞与细胞间的连接，因而阻断讯息传递，容易导致细胞失去分化能力，降低作为再生医学之细胞的质量。
刺激应答型高分子 ( stimuli-responsive
polymer ) 是指材料本身的结构或物理性质会随外在环境刺激(如：温度、酸碱值、电场或磁场等)，而发生转变。其中，温度敏感性高分子─聚异丙基丙烯醯胺 ( poly (
N-isopropylacrylamide )，PNIPAAm ) 具有相当灵敏的热应答行为，且相转变温度 ( lower
critical solution
temperature)约为32ºC，介于室温与体温之间，因此，该材料当前在生医工程领域已有相当广泛且重要的应用，如：生化分离 ( bioseparation )、控制释放 ( controlled
release ) 及创伤修复 ( wound dressing ) 等。
细胞层片组织工程的发展，即是为避免酵素分离方式对培养细胞的结构与功能影响。藉由表面改质技术，聚异丙基丙烯醯胺可经由共价键结接枝于培养皿表面。在37ºC的环境下，培养基材表面的聚异丙基丙烯醯胺高分子链，因疏水作用力造成结构相互纠结缠绕，而形成疏水性 ( hydrophobic ) 表面，能提供细胞贴附与生长；当温度降至25ºC时，水分子可进入其结构内与高分子链上的亲水性官能基形成氢键，使高分子链延展，转变为亲水性 ( hydrophilic ) 的表面，因而不利于细胞分泌的基质蛋白附着于培养皿，故促使细胞自发性地从培养基材脱附分离 ( detachment )。
由于未经蛋白分解酵素处理，此种利用温度调控的非侵入式系统，可获得完整结构的细胞层片，并有效保留细胞外基质与细胞生长因子受体，且能维持正确细胞形态及分化特性。同时，这些细胞层片也能藉由转载技术 ( transfer )，逐层堆栈为立体结构的组织，以达到接近天然组织层的厚度，或经由载体传输系统直接进行体内移植与治疗。采用此方法，当前学者已成功体外培养及体内移植心肌细胞 ( cardiomyocyte )、肝细胞 ( hepatocyte ) 及角膜轮部上皮细胞 ( limbal
epithelial stem cell ) 等各种层片组织替代物，并获得令人振奋的研究成果，尤其是在眼表面重建 ( ocular
surface
reconstruction ) 方面，细胞层片组织工程技术的应用已达到临床治疗阶段。该项研究报导指出，针对两眼均有轮部干细胞缺损的病患，仅需摘取其少量口腔黏膜组织 ( oral
mucosa )，即可用于体外培养在温度应答型界面，制备角膜上皮细胞层的完整片状组织替代物，并进行自体移植治疗。在此临床试验中，共有四位病患接受细胞层片移植。经由术后追踪十四个月的病例报告显示，患者受损的角膜组织在透明性 ( clarity ) 与再上皮化 ( reepithelialization ) 均已获得显著改善。因此，建基于温度敏感性材料所开发的细胞层片组织工程技术，预期未来在各种细胞疗法与再生医学领域，将具有无限潜质。
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